RNA實(shí)驗(yàn)和方案新手必讀（四）

在檢測RNA樣本時(shí)，需確保比色杯中去除了RNA酶，特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。該條件可通過使用0.1 M NaOH，1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來實(shí)現(xiàn)。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計(jì)設(shè)定空白對(duì)照。

在使用紫外通透的塑料比色杯的分光光度計(jì)中，測量260 nm的吸光值(A260)以確定RNA的濃度。為了確保獲得有意義的結(jié)果，讀值應(yīng)在0.15與1.0之間。在260 nm波長下，1個(gè)單位的吸光值對(duì)應(yīng)每毫升44 μg的RNA濃度（A260=1 → 44 μg/ml；基于標(biāo)準(zhǔn)的1 cm測光距離）。這一相關(guān)性僅對(duì)中性pH值條件下的檢測有效。因此，如需稀釋RNA樣品，則應(yīng)使用中性pH值的低鹽緩沖液（例如10 mM Tris?Cl ，pH7.0）。

在檢測RNA樣本時(shí)，需確保比色杯中去除了RNA酶，特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。這可以通過使用0.1 M NaOH，1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來實(shí)現(xiàn)。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計(jì)設(shè)定空白對(duì)照。列舉一個(gè)RNA定量中的計(jì)算實(shí)例如下：

RNA定量舉例
RNA樣品的體積= 100 μl
稀釋=10 μl RNA樣品+490μl 10 mM Tris?Cl ，pH 7.0（1/50的稀釋比）
使用1 ml（已去除RNA酶）比色杯，檢測稀釋后樣本的吸光度
A260 = 0.2

RNA濃度
= 44 μg/ml x A260 x稀釋系數(shù)
= 44 μg/ml x 0.2 x 50 
= 440 μg/ml

RNA總量 
=濃度x以毫升為單位的樣品體積
= 440 μg/ml x 0.1 ml 
= 44 μg RNA

RNA純度

在260 nm與280 nm讀值之間的比例（A260/A280）能夠反映RNA的純度，因?yàn)槿绲鞍滓活惖奈廴疚飼?huì)吸收紫外光。不過，A260/A280的比值也受到pH值的顯著影響。當(dāng)使用沒有緩沖能力的水時(shí)，pH值與A260/A280的比值結(jié)果都會(huì)發(fā)生大范圍的改變。 較低的pH值會(huì)導(dǎo)致A260/A280的比值變小，對(duì)蛋白質(zhì)污染的敏感性也會(huì)隨之降低（3）。

為了獲得的比率，我們建議在微堿的低鹽緩沖液中檢測吸光度（例如10 mM Tris?Cl，pH7.5）。在10 mM Tris?Cl，pH 7.5緩沖液當(dāng)中，純RNA的A260/A280 比率約為1.9–2.1。

注：某些分光光度計(jì)在檢測純RNA時(shí)，可常規(guī)獲得高達(dá)2.3的比值。

請(qǐng)確保使用同種溶液校準(zhǔn)分光光度計(jì)。不過，為了準(zhǔn)確確定RNA的濃度，我們?nèi)越ㄗh使用中性緩沖液稀釋RNA樣本，因?yàn)槲舛群蜐舛龋ˋ260讀值為1相當(dāng)于44 μg/ml的RNA濃度）之間的關(guān)系是一個(gè)基于中性條件獲得的吸光系數(shù)。

RNA的完整度

總RNA的完整度和大小分布可以通過變性的瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色或市售的檢測系統(tǒng)（如QIAxcel系統(tǒng)或Agilent 2100 ）進(jìn)行檢測。每條核糖體RNA的富集區(qū)域在凝膠染色之后應(yīng)顯現(xiàn)為銳利的條帶。28S核糖體RNA的條帶亮度應(yīng)為18S rRNA條帶的兩倍左右。如果某一泳道中核糖體RNA條帶不夠銳利，卻出現(xiàn)小尺寸RNA的彌散情況，則很可能因?yàn)镽NA樣品在制備過程中發(fā)生了嚴(yán)重的降解。

Agilent 2100 Bioanalyzer也能夠RNA完整數(shù)目（RNA Integrity Number，RIN）這一參數(shù)，作為對(duì)RNA完整度的一個(gè)有用量度。在理想情況下RIN值應(yīng)接近10，不過在許多情況下（特別是對(duì)組織樣本來說），RNA品質(zhì)主要取決于原始樣本的保存情況。

不同來源的核糖體RNA大小

變性凝膠分析的原理

利用RNA在甲醛瓊脂糖凝膠中的電荷遷移效應(yīng)，可對(duì)RNA進(jìn)行分離和鑒定。RNA不像DNA，它們具有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此需使用變性凝膠。凝膠中的甲醛能夠破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使得RNA分子嚴(yán)格按照電荷遷移的方式得到有效分離。

在電場中，主鏈磷酸基團(tuán)上所攜帶的負(fù)電荷使核酸分子向陽極移動(dòng)。變性的RNA分子的遷移速率取決于它們的尺寸大??；不過片段大小與遷移速率之間并非線性相關(guān)，因?yàn)楦蟮钠螘?huì)遇到更大的摩擦阻力，在凝膠中移動(dòng)更為困難。

瓊脂糖凝膠分析是為常用的RNA分析方法，通常依據(jù)RNA的大小相應(yīng)選擇合適分辨范圍的瓊脂糖凝膠。小的RNA片段，如tRNA或5S rRNA，可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析?？刹殚喎肿由飳W(xué)手冊(cè)（2,4）以獲得關(guān)于各類分析膠的詳細(xì)信息。本節(jié)將針對(duì)甲醛瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行介紹。

制備用于RNA分析的甲醛瓊脂糖凝膠

下列甲醛瓊脂糖（FA）凝膠電泳方案能夠提高凝膠分離及后續(xù)檢測（例如RNA印跡）的靈敏度。本方案的關(guān)鍵特點(diǎn)在于使用了濃縮的RNA上樣緩沖液，從而（相比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方案）能夠向凝膠中載入更大量的RNA樣本。

瓊脂糖

用于制備凝膠的瓊脂糖是針對(duì)所分離RNA片段的大小來確定濃度范圍的。對(duì)于大多數(shù)的目的RNA種類來說，使用1.0–1.2%（質(zhì)量體積比）的瓊脂糖濃度可獲得佳結(jié)果。對(duì)于較大的mRNA種類，降低瓊脂糖濃度可能會(huì)有所幫助。如需分離更小的mRNA，瓊脂糖濃度可提高至2%。對(duì)于較小的RNA種類，如tRNA或rRNA，則推薦使用聚丙烯酰胺凝膠電泳。

請(qǐng)使用超純瓊脂糖，因?yàn)槿缍嗵穷?、鹽類和蛋白一類的雜質(zhì)都會(huì)對(duì)RNA的遷移造成影響。

小貼士：某些電泳槽的塑料不耐乙醇。請(qǐng)對(duì)此適當(dāng)留意，并核對(duì)廠商的說明書。

Total RNA-甲醛瓊脂糖凝膠

每個(gè)泳道10ug RNA