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一些樣本來源在其RNA或內(nèi)含物方面存在著顯著不同，可能導(dǎo)致RNA的分離和分析過程出現(xiàn)問題。當(dāng)操作這些樣本來源時(shí)需要一些特別注意事項(xiàng)。本節(jié)將針對(duì)大量不同樣本來源的操作進(jìn)行探討。
植物
從植物材料中分離RNA會(huì)遇到一些特殊困難，常規(guī)技術(shù)在用于植物樣本之前一般要先經(jīng)過條件優(yōu)化。一些植物代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)與核酸相似，導(dǎo)致其難于從RNA制備產(chǎn)物中除去。（使用不當(dāng)?shù)模┘兓椒ǎㄈ琨}類或苯酚）所導(dǎo)致的代謝物（例如多糖類、多酚類和黃酮類）或污染物與目的RNA的共分離，可能造成對(duì)酶促反應(yīng)的抑制，或?qū)е伦贤夥止夤舛葴y(cè)定和凝膠電泳結(jié)果上的偏差。從植物材料中分離RNA的過程中可能遇到的困難還包括由于較高粘性導(dǎo)致的吸取體積錯(cuò)誤，以及儲(chǔ)存過程中的RNA降解問題。
通常對(duì)植物的生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，使其不產(chǎn)生高水平的植物代謝產(chǎn)物，可有助于對(duì)RNA的有效分離。由于植物種類之間存在較大差異，因此對(duì)其生長(zhǎng)條件很難有同一的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)。不過作為普適原則，建議盡可能使用健康幼嫩的植物組織。年輕植物組織的RNA得率通常高于年老組織，因?yàn)榍罢咴诘戎貤l件下通常比后者包含更多的細(xì)胞。而且等重的年輕組織通常也包含更少的代謝物。此外，許多“自定義”的RNA分離方法都推薦將植物組織在黑暗中培養(yǎng)1–2天后再進(jìn)行收獲，以避免形成植物代謝物的高水平積累。
心臟、肌肉和皮膚組織
從例如骨骼肌、心臟和皮膚組織一類的樣本中分離RNA可能比較困難，因?yàn)榇祟悩悠分泻写罅康氖湛s性蛋白、結(jié)締組織和膠原。為了去除這些可能對(duì)RNA分離造成干擾的蛋白，需要使用蛋白酶或含苯酚的裂解試劑對(duì)此類樣本進(jìn)行處理。不過，蛋白酶的消化過程需要避免RNA發(fā)生降解。
**
**mRNA的很多基本特征都不同于真核生物的mRNA。原核生物的mRNA沒有5’帽子，也很少具有poly A尾。缺少poly A尾的mRNA無法通過雜交進(jìn)行捕獲。另外，也無法在合成初始鏈的過程中使用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷（oligo–dT）引物，只能使用隨機(jī)引物作為替代。
此外，**RNA也十分地不穩(wěn)定，快速生長(zhǎng)的品種中RNA的平均半衰期約為3分鐘。某些**的mRNA在翻譯同時(shí)即發(fā)生降解。因此對(duì)于嘗試從**中分離mRNA的研究人員來說，這可算是一個(gè)**煩。也由于**中的mRNA的周轉(zhuǎn)（從生成到降解）非?？?，造成原核生物的基因表達(dá)研究比真核生物更為困難。為了地保留基因表達(dá)譜，并使完好mRNA的得率大化，在樣本獲取和加工之前需要對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定處理。
血液
血液直接源于臨床分析的收集樣本。在收集管中使用RNA穩(wěn)定處理試劑可成功保存血液樣本的RNA。從血液中分離RNA的方法，需要能夠確保生成無污染物或酶抑制劑的高質(zhì)量RNA。血液中所含有的大量酶抑制劑會(huì)對(duì)下游的RNA分析造成干擾。此外，如肝素和EDTA等一類常規(guī)的抗凝血?jiǎng)┮矔?huì)干擾下游分析。應(yīng)注意抗凝血?jiǎng)┎⒉粫?huì)對(duì)RNA起到穩(wěn)定化作用。
人類血液中的紅血球（血紅細(xì)胞）不含細(xì)胞核，因此不會(huì)合成RNA；通常情況下這類細(xì)胞僅含有非常微量的RNA，而不是RNA分離的主要對(duì)象。從全血中分離RNA的主要靶標(biāo)細(xì)胞為白血球（白細(xì)胞），這類細(xì)胞含有細(xì)胞核和RNA。白血球由三種主要的細(xì)胞類型構(gòu)成：**細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。
由于健康的血液中所含的紅細(xì)胞數(shù)量約為白細(xì)胞的1000倍，去除紅細(xì)胞會(huì)有助于簡(jiǎn)化RNA分離步驟。可通過選擇性地裂解紅細(xì)胞來達(dá)到此目的，因?yàn)榧t細(xì)胞對(duì)低滲休克更為敏感（相比白血球），在低滲緩沖液中會(huì)迅速發(fā)生破裂。
裂解紅細(xì)胞的另一種常見替代方法是Ficoll密度——梯度離心法。與紅血球裂解法不同，F(xiàn)icoll密度——梯度離心法僅獲取單核的細(xì)胞（**細(xì)胞和單核細(xì)胞），而會(huì)去除粒細(xì)胞。經(jīng)Ficoll密度––梯度離心法分離出的單核細(xì)胞能夠使用與其他動(dòng)物細(xì)胞一樣的方法進(jìn)行RNA分離。
FFPE組織樣品
福爾馬林固定，石蠟包埋(FFPE)的組織樣本是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要和廣泛的樣本來源。越來越多的研究者開始針對(duì)FFPE樣本開始分子水平的分析，因此考慮這些樣本的獨(dú)特屬性以發(fā)展針對(duì)性的分離方法變得越來越重要。
由于在固定和包埋過程中使用了甲醛，通常會(huì)使FFPE樣本中的核酸發(fā)生嚴(yán)重的片段化和化學(xué)改變。因此，從FFPE樣本中分離到的核酸會(huì)比新鮮樣本或冰凍樣本的分子量更低。其片段化程度基于樣本類型、保存期長(zhǎng)短，以及固定、包埋和儲(chǔ)存的條件而發(fā)生變化。盡管在凝膠電泳或芯片實(shí)驗(yàn)室（lab–on–a–chip）分析等標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制分析中無法測(cè)得甲醛修飾情況，但后者實(shí)際會(huì)對(duì)酶學(xué)分析造成嚴(yán)重干擾。
為了將FFPE儲(chǔ)存法對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄物的影響降至低，應(yīng)牢記下列小貼士：
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盡可能快地取樣和固定組織
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不要使用厚度超過5 mm的樣本，樣本固定時(shí)間不宜過長(zhǎng)（長(zhǎng)24小時(shí)）
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使用的試劑進(jìn)行石蠟包埋，不要加入其它添加劑
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盡可能避免對(duì)樣本進(jìn)行染色
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適當(dāng)?shù)貎?chǔ)存FFPE樣本（RNA在4°C可完好保存至1年，優(yōu)于保存在室溫或更高溫度）
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使用適當(dāng)?shù)拿撌灢襟E
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RNA分離應(yīng)包含一個(gè)解交聯(lián)的步驟
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