1.樣品處理：對(duì)被分離樣品有時(shí)要經(jīng)過(guò)水解等化學(xué)處理，樣品溶液一般要兼顧到濃度與粘度兩方面。離子交換柱的安裝：層析柱內(nèi)徑必須粗細(xì)均勻，柱管大小可據(jù)實(shí)際需要選擇。柱下端膠塞中插入一放液管，膠塞上蓋以園形尼龍綢或發(fā)泡塑料片以防止交換樹(shù)脂流出。裝柱：⑴裝柱質(zhì)量是確保柱層析分離效果的技術(shù)關(guān)鍵之一，越是高技術(shù)層析(如使用毛細(xì)管層析柱的層析設(shè)備)裝柱的技術(shù)要求和難度越高，以至手工操作很難達(dá)到。⑵裝柱的質(zhì)量要求，無(wú)論是手工、機(jī)械、自動(dòng)化裝柱都是一樣的，要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無(wú)氣泡、無(wú)斷層、無(wú)結(jié)節(jié)，能保持正常的溶脹形態(tài)和結(jié)構(gòu)；⑶裝入柱中樹(shù)脂的高度與直徑之比因分離對(duì)象和分離目的不同而相差很大，本教材推薦的肝素鈉洗脫柱裝柱高度是柱徑的4～6倍。⑷操作次序，以手工裝入溶脹的D254樹(shù)脂(濕法裝柱)為例，其操作程序可概括為：①查連接(柱與塞之間、上下塞與進(jìn)出液管之間、梯度混合器與進(jìn)液管之間、出液管與收集器之間等等的連接是否正確、緊密)，②試止漏(塞子、接頭、活塞開(kāi)關(guān)處在長(zhǎng)時(shí)間滿負(fù)荷下不泄漏)，③加隔離緩沖墊(緊貼于柱子下端塞子的內(nèi)平面)，④加少許平衡液于空柱內(nèi)，⑤趕氣泡(緩沖墊內(nèi)和出水管中的氣泡)，⑥開(kāi)通放水開(kāi)關(guān)，⑦與放水量保持相當(dāng)?shù)牧魉?，向柱?nèi)勻速加完載體材料漿，⑧關(guān)閉放水開(kāi)關(guān)，令樹(shù)脂自然下沉，⑨用洗滌液和清水洗滌樹(shù)脂，⑩后用緩沖液過(guò)柱和平衡柱，使樹(shù)脂結(jié)構(gòu)平衡穩(wěn)定，⑾在樹(shù)脂表面蓋上一片尼龍或泡膜塑料，并與柱子內(nèi)壁保持嚴(yán)密接觸，以防加樣時(shí)樹(shù)脂泛起。加樣：緩緩打開(kāi)柱子下端的放液開(kāi)關(guān),使柱內(nèi)液面剛好降至樹(shù)脂面時(shí)便立即將樣品溶液小心地加到尼龍或泡膜塑料片上，待樣品液面剛好進(jìn)入樹(shù)脂層內(nèi)便立即加入少許平衡緩沖液,以清洗粘附在覆蓋層中的樣品，并隨之進(jìn)入樹(shù)脂層。當(dāng)柱內(nèi)液位接近樹(shù)脂表面時(shí)便立即添加洗滌液進(jìn)行洗滌操作。5.洗滌：選用合適的洗滌液、恰當(dāng)?shù)目傆昧考跋礈炝魉?，小心洗滌柱?nèi)樹(shù)脂，以除去不被離交樹(shù)脂吸附的雜質(zhì)。6.洗脫：由洗脫曲線找出洗脫液的佳濃度和適當(dāng)?shù)目偭俊⒉僮鲏杭傲魉龠M(jìn)行洗脫。7.監(jiān)測(cè)：用敏感快速的方法(參見(jiàn)下文“測(cè)定”)監(jiān)測(cè)分離成分是否洗脫出來(lái)以及洗脫峰的軸向分布8.收集：一旦發(fā)現(xiàn)待分離成分洗脫出來(lái)便可進(jìn)行一步或分步收集，并可根據(jù)各成分洗脫峰的軸向分布和濃度監(jiān)測(cè)，決定產(chǎn)品收集濃度區(qū)段，棄去的洗脫液可循環(huán)用于相同成分的洗脫。9.沉淀/離心：用沉淀劑可將分離組分沉淀或離心下來(lái)脫水干燥，沉淀劑回收再用。10.脫水干燥：加入適當(dāng)脫水劑為如無(wú)水乙醇、丙酮或乙醚脫水后進(jìn)一步干燥。11.測(cè)定：對(duì)層析所得產(chǎn)品可稱重或測(cè)定活性計(jì)算其得量和收率。【注意事項(xiàng)】1.應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)的理化性質(zhì)、分子大小、分子形狀和分離的目的要求，選擇分離效果好、交換容量大而機(jī)械強(qiáng)度較高的分離載體材料。市售的分離載體有明確的規(guī)格型號(hào)、理化性質(zhì)、功能作用、活化再生和保養(yǎng)存放等技術(shù)參數(shù)資料可供用戶選擇。2.應(yīng)根據(jù)分離純化的對(duì)象、規(guī)模選擇層析柱的長(zhǎng)短、粗細(xì)、柱高與內(nèi)徑之比，使達(dá)到佳分離效果；此外，柱子材料的化學(xué)性質(zhì)要穩(wěn)定、透明，內(nèi)徑要均一、光滑，死腔要愈小愈好，要有利于緊固、連接、裝柱與維護(hù)。3.柱子安放要垂直、穩(wěn)固，與之相連的各種線路、管道、設(shè)備、設(shè)施的布局和連接要緊奏，要方便操作、觀察與維護(hù)。4.要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無(wú)氣泡、無(wú)斷層、無(wú)結(jié)節(jié)，能保持正常的溶脹形態(tài)和結(jié)構(gòu)。5.保持柱內(nèi)樹(shù)脂層面平整、層序結(jié)構(gòu)始終如一是確保柱層析分離效果的又一技術(shù)關(guān)鍵。為此，從裝柱到洗脫結(jié)束的過(guò)程中，尤其是加樣、洗滌、洗脫過(guò)程中要始終保持柱內(nèi)液位不低于柱內(nèi)樹(shù)脂的頂部平面，尤其要始終保持柱內(nèi)樹(shù)脂的層序結(jié)構(gòu)始終如一，不被打亂，特別要防止更換濃度不同的洗滌洗脫液時(shí)發(fā)生“翻缸”而攪亂樹(shù)脂層結(jié)構(gòu)，“壓缸”而造成柱層斷裂和梗塞斷流。6.注意保持一定的操作壓，這對(duì)確保層析柱流速和分離效果十分重要。因?yàn)榱魉俨粌H與洗脫液加在柱上的壓力(因液面差造成)有關(guān)，也與裝柱材料的粒度、交聯(lián)度、機(jī)械強(qiáng)度有關(guān)。應(yīng)針對(duì)具體情況建立一個(gè)操作壓、流速和分離效果的佳平衡點(diǎn).顯著標(biāo)明各種洗滌、洗脫液的技術(shù)參數(shù)，嚴(yán)禁亂用和混用。7.制作洗脫曲線，確定洗脫液收集方案，設(shè)置洗脫監(jiān)控點(diǎn)8.注意剔除破損樹(shù)脂，及時(shí)補(bǔ)足流失、破損的循環(huán)樹(shù)脂量。9.嚴(yán)格掌握新、舊樹(shù)脂的活化、再生條件，及時(shí)再生舊樹(shù)脂。樹(shù)脂的再生：每次洗脫結(jié)束，用清水將樹(shù)脂洗出柱體再用、再生，或用高濃度的NaCl溶液浸泡貯存。樹(shù)脂經(jīng)過(guò)一段使用后樹(shù)脂上的活性基團(tuán)因被交換而使交換容量大為降低，此時(shí)樹(shù)脂需要再生處理。大處理(酸—堿—酸)：加入樹(shù)脂2倍量的2mol HCL溶液攪拌3小時(shí)，自來(lái)水沖洗至中性；又用2mol NaOH溶液照酸處理方式處理；再用2mol HCL處理。小處理(堿—酸)：濃度、方法同上。連續(xù)用數(shù)次的樹(shù)脂進(jìn)行小處理，用十次后的樹(shù)脂要進(jìn)行大處理。10．注意脫水干燥條件。上海金鵬分析儀器有限公司 www.jp1718.com電話：021-36162366 60959971 61425398 手機(jī)： 13764356938 18918199710 13585698333 QQ:842727501，964122960，765695826， 2460311703， 2431022418，170324176傳真：021-36162369地址：上海市真陳路1398弄15號(hào) 郵編：200444